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            產朊假絲酵母菌檢驗標準操作程序



            錄入時間:2021-5-19 10:04:51 來源:青島海博生物

            標準依據:《GB/T 34224-2017 生物產品中功能性微生物檢測》


            1 設備和材料


            除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外,其他設備和材料如下。

            1.1 恒溫培養箱:28℃±1℃。

            1.2 冰箱:2℃~5℃。

            1.3 天平:感量為0.1g。

            1.4 均質器及無菌均質袋,均質杯。

            1.5 振蕩器。

            1.6 無菌吸管:1mL(具0.01mL刻度),10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸頭。

            1.7 無菌錐形瓶:容量250mL、500mL。

            1.8 無菌培養皿:直徑90mm。

            1.9 顯微鏡:10倍一100倍。

            1.10 pH計或pH比色管或精密pH試紙。


            2 培養基和試劑


            2.1 孟加拉紅瓊脂培養基。

            2.2 麥芽汁液體培養基。

            2.3 無菌生理鹽水。

            2.4 酵母菌生化鑒定試劑盒。


            3 檢驗程序


            產朊假絲酵母菌的檢驗程序見下圖。


            4 操作步驟


            4.1 樣品制備

            4.1.1 固體和半固體樣品

            稱取25g樣品,置于225mL生理鹽水的無菌均質袋中,用拍擊式均質器拍打lmin~2min制成1:10的樣品勻液;或置于盛有225mL滅菌生理鹽水的無菌均質杯中,8000r/min~10000r/min均質lmin~2min制成1:10的樣品勻液。

            4.1.2 液體樣品

            應先將其充分搖勻后,以無菌吸管吸取樣品25mL放入裝有225mL生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠)中,充分振搖﹐制成1:10的樣品勻液。


            4.2 樣品稀釋

            4.2.1 用1mL無菌吸管或微量移液器吸取l:10樣品勻液lmL,沿管壁緩慢注于裝有9 mL生理鹽水的無菌試管中(注意吸管尖端不要觸及稀釋液),振搖試管或換用1支無菌吸管反復吹打使其混合均勻,制成l:100的樣品勻液。

            4.2.2 另取1mL無菌吸管或微量移液器吸頭,按上述操作順序,做10倍遞增樣品勻液,每遞增稀釋一次,即換用1次lml滅菌吸管或吸頭。


            4.3 培養

            根據對待檢樣品菌含量的估計,選擇2個~3個連續的適宜稀釋度﹐每個稀釋度吸取樣品勻液0.2mL接種于孟加拉紅瓊脂平板內,使用涂布棒盡可能小心快速地涂布接種液于瓊脂表面,涂布棒不得接觸平皿邊緣。每個稀釋度接種2個平板。涂布后,將平板靜置10 min使接種物完全被培養基吸收。翻轉平皿置于28℃±1℃厭氧培養箱中培養72h±2h。


            4.4 菌落計數

            4.4.1 選取特征菌落數在10CFU~150CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計數菌落總數。低于10 CFU的平板記錄具體菌落數,大于150 CFU的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數應采用兩個平板的平均數。

            4.4.2 其中一個平板有較大片狀菌落生長時,則不宜采用,而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數;若片狀菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均勻,即可計算半個平板后乘以2,代表一個平板菌落數。


            4.5 鑒定

            4.5.1 菌落挑選和純培養

            挑選平板上5個紅色、平滑、邊緣齊整的菌落分別轉入麥芽汁液體培養基28℃±1℃培養箱中培養24h-48h后進行形態學、生化鑒定。

            4.5.2 形態學鑒定

            革蘭氏染色,鏡檢。產朊假絲酵母呈球形或臘腸形,大�。�3.5-4.5)um×(7.0-13.0)um,多邊芽殖,能形成假菌絲或有隔菌絲。

            4.5.3 生化鑒定

            使用酵母菌生化鑒定試劑盒進行生化鑒定。鑒別特征參見表B.7。


            5 結果計算


            5.1每個平板中產朊假絲酵母菌的數量

            每個平板中產朊假絲酵母菌菌落數的計算見式(1):

              a=b/A×C              ...............(1)

              式中

              a-每塊平板上的產朊假絲酵母菌菌落數;

              b-挑取后經證實為產朊假絲酵母菌的菌落數;

              A-挑取平板上用于驗證的菌落數;

              C-平板上的所有特征菌落數。


            5.2 菌落總數的計算方法

            5.2.1 若只有一個稀釋度平板上的菌落數在適宜計數范圍內,計算兩個平板中產朊假絲酵母菌菌落數的平均值,再將平均值乘以相應稀釋倍數,作為每克(毫升)中菌落總數結果。

            5.2.2 若有兩個連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數范圍內時,按式(2)計算:

              N=∑C/(n1+0.1n2)×d      ...............(2)

              式中:

              N-樣品中菌落數;

              ∑C-平板(含適宜范圍菌落數的平板)菌落數之和;

              n1-第一稀釋度(低稀釋倍數)平板個數;

              n2-第二稀釋度(高稀釋倍數)平板個數;

              d-稀釋因子(第一稀釋度)。


            6 報告


            6.1 結果判定

            若樣品菌落符合產朊假絲酵母菌形態學及生化鑒定的特征,可判定為產朊假絲酵母菌。


            6.2 結果報告

            6.2.1 定性報告

            在25g(mL)樣品中檢出或未檢出產朊假絲酵母菌。

            6.2.2 定量報告

            菌落數小于100CFU時,以整數報告。菌落數大于或等于100CFU時,對第3位數字進行修約后,取前2位數字,后面用0代替位數;也可用10的指數形式來表示,采用兩位有效數字。



              本文節選自《GB/T 34224-2017 生物產品中功能性微生物檢測》。

            附:

            GB/T 34224-2017 生物產品中功能性微生物檢測 點擊下載

            GB/T 34224-2017 生物產品中功能性微生物檢測標準用到的培養基 點擊下載


             

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